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　　大豆疫霉病是全球大豆产业的 “心腹之患”，每年造成巨额产量损失。大豆中的异黄酮类物质，既是对人体有益的天然营养成分，也是植物抵御病原菌侵袭的 “核心防线”。异黄酮广泛存在于豆科植物中，大豆作为其富集来源，含大豆苷元、染料木素、黄豆黄素三大类异黄酮及其糖苷化、丙二酰化衍生物。其中黄豆黄素的生物合成路径长期存在争议——传统观点认为其源于甘草素（Liquiritigenin）的 6 -羟基化途径，却缺乏充足的体内实验证据。

　　研究团队对 727 份大豆自然群进行代谢组全基因组关联分析（mGWAS），成功将黄豆黄素及其衍生物的调控位点精准定位到 11 号染色体的 200 kb 区域，最终筛选出关键基因 GmIF6H1（isoflavone 6-hydroxylase 1）。大豆毛状根实验验证显示，过表达 GmIF6H1 可显著提高黄豆黄素及其衍生物含量。进一步的体外酶活实验证实，GmIF6H1 具备严格的底物特异性，可精准催化异黄酮苷，发生 6-羟基化反，进而明确了 GmIF6H1 的核心生化功能为异黄酮 6-羟化酶。结合系统进化分析与体外酶活验证结果，证实 6-羟基化功能在豆科植物中具有进化保守性。

　　深入分析发现，GmIF6H1 基因存在一个关键单核苷酸多态性（SNP），导致其编码蛋白第 248 位氨基酸由苏氨酸（Thr）替换为丙氨酸（Ala）。这一微小变异带来显著功能差异：携带 Thr248的大豆材料（Hap2 单倍型）黄豆黄素含量显著高于 Ala248型（Hap1 单倍型），酶动力学分析显示 Thr248变异体的催化效率是 Ala248型的 5 倍。

　　单倍型频率分析更揭示了人工选择的痕迹：野生大豆中高活性单倍型（Thr248）占比 83.33%，而在地方品种和栽培品种中均降至约 52%，这也解释了大豆驯化过程中黄豆黄素含量降低的分子机制。

　　团队通过 CRISPR-Cas9 技术构建了三个 GmIF6H1 缺失突变体，结果显示突变体中黄豆黄素几乎完全缺失，而其前体大豆苷元的含量显著上升。稳定同位素标记实验（大豆苷元-d6喂养）进一步证实，野生型大豆中可检测到黄豆黄素-d5及其衍生物，突变体中无相关标记产物，而过表达株系中标记产物及中间产物均大量积累。综合以上研究结果可知，GmIF6H 能够特异性催化大豆苷元的 6-羟基化反应，进而形成黄豆黄素。

　　令人意外的发现来自大豆疫霉菌接种实验：不仅 GmIF6H1 缺失突变体对疫霉病敏感性显著增加，过表达株系同样表现出抗性下降。分析表明这种 “双向敏感” 源于代谢平衡的破坏：

　　突变体中，黄豆黄素几乎完全缺失，作为 “预存植保素” 的第一道防御防线失效，导致感病性增强；外施 200 μM 黄豆黄素可恢复突变体的抗病性，直接证实其抗病功能；

　　过表达株系中，黄豆黄素含量显著升高，但作为 “诱导型植保素” 的大豆抗毒素 I 含量降低 1.6 倍。

　　研究提出大豆的双重防御策略：黄豆黄素作为预存植保素，在感染初期发挥即时防御作用；大豆抗毒素作为诱导型植保素，通过感染后基因转录激活和从头合成发挥持续防御作用。两者共享前体大豆苷元，GmIF6H1 的精准表达是维持这一平衡的核心——表达不足或过量都会导致防御失衡，增强感病性。

　　图 3. W82 与 GmIF6H1 转基因大豆对大豆疫霉菌的易感性（LC-QQQ 实现关键代谢物定量）

　　该研究的科学价值体现在多个维度：一是颠覆了黄豆黄素的传统合成路径认知，明确了大豆苷元为核心前体的主导路径；二是揭示了 “预存植保素 - 诱导型植保素” 协同防御的新机制，强调了代谢平衡对植物抗病性的重要性；三是鉴定了 GmIF6H1 这一关键基因及功能变异位点，为大豆抗病分子育种提供了直接靶点；四是建立的代谢组学与基因组学结合的分析方法，为其他作物的代谢调控研究提供了重要参考。

　　在这项复杂的代谢机制研究中，安捷伦 LC-QTOF 和 LC-QQQ 液质联用技术凭借卓越性能，全程为研究提供关键技术支撑。其中，LC-QTOF 对大豆种子及不同组织中的异黄酮进行全面筛查与结构确证，为 mGWAS 基因定位提供了精准的表型数据；在酵母体外酶活实验中精准检测到 GmIF6H1 催化大豆苷元生成的产物，为路径验证提供了直接证据。而 LC-QQQ 承担了代谢物准确定量的核心任务，如在稳定同位素标记实验中定量大豆苷元在不同基因型大豆中的代谢产物；在大豆疫霉感染实验中量化了黄豆黄素与大豆抗毒素 I 的含量动态变化，清晰揭示了两者的代谢流竞争关系。

　　中国科学院遗传与发育生物学研究所博士生杨麒麟为论文第一作者，王国栋研究员为通讯作者。博士生王伊宁，徐鑫丹，中国科学院昆明植物所苑佳，遗传发育所代谢平台张凤霞，雀巢研发中心覃浩，中国农业科学院生物技术研究所李世豪，上海辰山植物园李建戌副研究员，中国农业科学院生物技术研究所林浩研究员，中国科学院遗传发育所李磊研究员，崖州湾国家实验室田志喜研究员参与了本研究。本研究得到生物育种国家科技重大专项、国家重点研发计划、中国科学院战略性前沿重点研究计划以及国家自然科学基金的资助。